SDS-PAGE（十二烷基聚丙烯酰胺凝膠電泳）是分離蛋白質混合物的核心實驗技術。以下是詳細的操作步驟、原理和關鍵注意事項，便于您理解和操作。

一、SDS-PAGE基本原理

1、變性： SDS使蛋白質變性，破壞其二、三、四級結構，并將大量負電荷均勻覆蓋在肽鏈上，掩蓋了蛋白質原有的電荷差異。

2、電荷一致： 所有SDS-蛋白質復合物均帶負電，在電場中向陽極遷移。

3、分子篩效應： 聚丙烯酰胺凝膠網狀結構對不同大小的蛋白質產生不同阻力。分子量越小，遷移越快。

因此，SDS-PAGE中蛋白質的遷移率主要取決于其分子量。

二、主要實驗步驟

整個過程可分為制膠、樣品準備、上樣與電泳、染色與分析四個階段。

A、制膠（以不連續系統為例）

不連續系統包含濃縮膠和分離膠，可提高分辨率和條帶銳度。

1、安裝制膠模具

清洗玻璃板并晾干，將其固定于制膠架上，確保底部密封。

2、配制分離膠（下層膠，決定分辨率）

選擇合適濃度： 根據目標蛋白分子量范圍選擇凝膠濃度（通常8%-15%）。

（1）小分子蛋白（<30 kDa）→ 高濃度膠（12-15%）

（2）大分子蛋白（>100 kDa）→ 低濃度膠（8-10%）

（3）混合范圍（10-200 kDa）→ 常用12%

3、按配方混合： 依次加入水、30%丙烯酰胺混合液、分離膠緩沖液（如Tris-HCl， pH 8.8）、10% SDS、10%過硫酸銨（APS）和TEMED。TEMED催化聚合，應最后加入并立即混勻。

4、灌膠： 迅速將混合液注入玻璃板間隙至約2/3高度。

5、覆蓋液層： 輕輕加入異丙醇或水封層，壓平膠面并隔絕空氣，室溫垂直放置約30分鐘聚合。

6、配制濃縮膠（上層膠，使樣品濃縮成一條線）

（1）棄去封層液，用濾紙吸干。

（2）按配方混合： 混合水、30%丙烯酰胺混合液、濃縮膠緩沖液（如Tris-HCl， pH 6.8）、10% SDS、10% APS和TEMED。

（3）灌膠與插梳： 將混合液加在分離膠上，立即插入樣品梳，避免氣泡。室溫聚合約20-30分鐘。

B、樣品準備

1、蛋白質樣品： 與5× SDS上樣緩沖液混合（終濃度為1×）。

上樣緩沖液成分： SDS、DTT或β-巰基乙醇（還原劑，打斷二硫鍵）、甘油（增加密度）、溴酚藍（指示劑）、Tris-HCl（緩沖液）。

2、變性： 將混合后的樣品在95-100℃ 加熱5-10分鐘，使蛋白質充分變性和還原。

3、短暫離心： 加熱后短暫離心，收集管壁冷凝液。

C、上樣與電泳

1、安裝電泳槽： 將凝固的凝膠板放入電泳槽內，加入1× 電泳緩沖液（含Tris、甘氨酸、SDS）。內外槽均需加滿緩沖液。

2、拔梳與上樣：

（1）輕輕垂直拔出樣品梳。

（2）使用微量上樣器，將準備好的蛋白樣品和蛋白分子量標準品（Marker） 依次加入加樣孔。

（3）關鍵： 記錄上樣順序，Marker孔。

3、連接電源與電泳：

（1）正確連接電極（黑對黑，紅對紅，負極在上）。

（2）恒壓電泳： 推薦先以80-90V電壓電泳，待溴酚藍指示線進入分離膠后（約30分鐘），將電壓提高至120-150V繼續電泳。

（3）終點判斷： 當溴酚藍前沿遷移至凝膠底部約0.5-1 cm時，關閉電源。

D、染色與分析

1、取膠： 拆卸裝置，小心撬開玻璃板，取出凝膠。

2、固定與染色（以考馬斯亮藍R-250快速染色為例）：

（1）固定： 將凝膠放入固定液（如甲醇:乙酸=5:1）中搖動15分鐘。

（2）染色： 轉移至考馬斯亮藍染色液中，搖動30分鐘至數小時。

（3）脫色： 移入脫色液（甲醇、乙酸、水混合物）中搖動，期間更換脫色液數次，直至背景透明、條帶清晰。

（4）成像與分析： 用凝膠成像系統拍照，根據Marker條帶的位置，可繪制標準曲線并估算目標蛋白的分子量。

三、關鍵注意事項與常見問題

1、安全重要性：

丙烯酰胺單體具有神經毒性，操作液態丙烯酰胺或粉末時必須戴手套，在通風處配制。

電泳時勿觸摸電極，防止觸電。

2、制膠關鍵：

分離膠和濃縮膠的pH不同，是形成不連續系統的關鍵，切勿混淆。

APS和TEMED是催化劑，應分裝保存于4℃或-20℃，避免失效。

灌膠后若聚合過快或不聚合，檢查APS/TEMED的活性和用量。

3、電泳關鍵：

確保電泳緩沖液新鮮，且內外槽緩沖液連通（對于垂直板電泳槽）。

初始電壓不宜過高，否則會導致條帶扭曲（“微笑"效應）。

4、結果不佳的常見原因：

條帶彌散/拖尾： 蛋白質降解或上樣量過大。

條帶彎曲/歪斜： 凝膠聚合不均、上樣速度過快產生氣泡、電泳溫度過高。

分子量估算不準： 蛋白質糖基化、磷酸化等修飾會影響遷移；非還原條件也會影響。

無條帶或信號弱： 蛋白濃度過低、轉膜/染色失敗、抗體失效（對于Western Blot）。