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實驗室電泳技術根據其核心原理——即分離物質所依據的主要驅動力和介質——可以分為以下幾大類。其中,瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳是經典的兩種,分別屬于篩分型電泳的不同分支。
以下是按照實驗方法的分類詳解:
一、按分離原理(驅動力/介質)分類
1、區帶電泳
這是常用的一類,在一種連續、均勻的緩沖液(支持介質)中進行。樣品分子被分離成獨立的、不連續的區帶。我們常說的凝膠電泳大多屬于此類。
(1)核心:使用支持介質(如瓊脂糖、聚丙烯酰胺)來減少對流和擴散,提高分辨率。
(2)示例:瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、毛細管區帶電泳。
2、等電聚焦
(1)分離依據:蛋白質(或其他兩性分子)的等電點。
(2)原理:在凝膠中建立一個穩定的、線性的pH梯度。當施加電場時,蛋白質會遷移至其凈電荷為零的位置,即其等電點處,并聚焦成一條極窄的帶。分辨率高。
(3)應用:主要用于分析蛋白質的微異質性和測定等電點。
3、等速電泳
(1)分離依據:分析物的有效淌度。
(2)原理:使用不連續的電解質系統,由前導電解質(離子淌度高)和尾隨電解質(離子淌度低)組成。樣品離子的淌度介于兩者之間。分離后,各組分形成獨立的、相鄰的區帶,并以相同的速度移動。
(3)特點:區帶界面清晰,可用于定量,但操作較復雜。
(4)應用:毛細管電泳中應用較多。
4、免疫電泳
(1)分離依據:抗原的電泳遷移率和與其抗體的特異性免疫反應。
(2)原理:進行常規區帶電泳將抗原分離,然后在與電泳方向平行的槽中加入相應抗體,進行雙向擴散。在抗原抗體比例適宜處形成可見的沉淀弧。
(3)應用:用于檢測和鑒定復雜混合物中的特定抗原(蛋白質)。
5、雙向電泳
(1)分離依據:在兩個維度上使用不同的分離原理。
(2)原理:這是蛋白質組學的核心技術。
(3)一向:基于電荷的分離,通常使用等電聚焦。
(4)二向:基于分子量大小的分離,使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。
(5)結果:蛋白質點分布在二維圖譜上,可以同時分離數千種蛋白質。
二、按支持介質(凝膠類型)分類
這是常見的日常分類方式,直接決定了實驗方法的選擇。
1、瓊脂糖凝膠電泳
(1)介質:瓊脂糖(天然多糖)。
(2)特點:
孔徑大,分辨率相對較低。
制備簡單快捷,無毒。
操作電壓較低。
(3)主要應用:分離大分子核酸(DNA、RNA),片段大小通常在0.1kb - 50kb。
(4)方法變種:脈沖場凝膠電泳(用于分離超大DNA分子)。
2、聚丙烯酰胺凝膠電泳
(1)介質:聚丙烯酰胺(化學合成聚合物)。
(2)特點:
孔徑小且可精確調控(通過改變單體濃度)。
分辨率高,可達單堿基差異。
需要化學聚合(通常用AP和TEMED),有神經毒性。
可耐受高電壓,分離速度快。
(3)主要應用:分離小片段核酸(如DNA測序、小RNA)和蛋白質。
(4)核心方法變種:
天然PAGE:分離依據為分子大小、形狀和電荷。用于分析天然蛋白質或核酸復合物。
變性PAGE:
SDS-PAGE:在蛋白質樣品和凝膠中加入SDS和還原劑,使蛋白質變性并帶上大量負電荷,分離僅基于分子量。這是分析蛋白質分子量的金標準。
尿素-PAGE:用于分離單鏈核酸或RNA,變性劑為尿素。
3、非凝膠支持介質電泳
(1)紙電泳:使用濾紙作為支持介質,現已較少使用。
(2)醋酸纖維素薄膜電泳:常用于臨床血清蛋白分析,速度快,但分辨率不高。
三、按儀器形式分類
1、平板電泳(水平/垂直)
(1)水平電泳:常用于瓊脂糖凝膠電泳。凝膠水平放置于緩沖液槽中。
(2)垂直電泳:常用于聚丙烯酰胺凝膠電泳。凝膠垂直夾在兩塊玻璃板之間,緩沖液槽位于上下兩端。
2、毛細管電泳
(1)介質:在極細的熔融石英毛細管中進行,管內充滿緩沖液。
(2)原理:分離在毛細管內的自由溶液中進行,依靠電滲流和溶質的電泳淌度進行分離。
(3)特點:
自動化程度高,樣品用量少。
分辨率高,分析速度快。
可在線檢測。
(4)類型:包含毛細管區帶電泳、毛細管等電聚焦、毛細管凝膠電泳等多種模式,廣泛應用于核酸、蛋白質、小分子離子和手性分子分析。
結論:在實驗室中,“按實驗方法分類"通常意味著根據研究目的選擇合適的凝膠類型和電泳模式。例如,要分析PCR產物,就會選擇瓊脂糖凝膠電泳;要分析蛋白質分子量,就會選擇SDS-PAGE;要進行精細的蛋白質分離,則可能采用雙向電泳。